Imali smo deset dana velikih vijesti o pandemiji u Hrvatskoj. Najprije je iz Klinike za infektivne bolesti “Dr. Fran Mihaljević” stigla vijest o izoliranju novog koronavirusa SARS-CoV-2, pa je istog tjedna stigla i vijest o uspješnom sekvenciranju genoma novog koronavirusa.
I kao da je Stožer civilne zaštite zaključio da imamo i konkretnu efikasnu obranu, objavio je podizanje mjera. Sekvenciranje genoma SARS-CoV-2 iznimno je važan znanstveni pothvat koji je ostvaren pod vodstvom dr. sc. Olivera Vugreka iz Laboratorija za naprednu genomiku na Institutu “Ruđer Bošković”, a u suradnji s izv. prof. Igorom Jurakom s Odjela za biotehnologiju Sveučilišta u Rijeci te prof. dr. sc. Tomislavom Rukavinom i dr. med. Nevenom Sučićem s Medicinskog fakulteta u Rijeci i Nastavnog zavoda za javno zdravstvo u Rijeci. Kako je u svijetu već sekvencirano gotovo 12.000 genoma virusa SARS-CoV-2, znanstvenici svoj uspjeh ne smatraju senzacijom. Međutim, posebne su okolnosti u kojima se taj uspjeh dogodio, a riječ je potresu u Zagrebu. I to 23. travnja, baš tijekom postupka sekvenciranja, kada je instrument bio otprilike na pola puta u svom radu, koji ukupno traje 22 sata za određivanje genoma virusa.
Sekvenciranje genoma – 750 eura
– Uređaji koje vidite dolaze od američke tvrtke Illumina na kojoj se danas provodi 99 posto ovakvih projekata. Vrijede 100.000 i 250.000 eura, plaćeni su europskim novcem, jedno kućište za uzorak iz kojeg se genom pročita košta tisuću eura i jednokratno je – kaže nam dr. Vugrek, koji nas je dočekao u svojem laboratoriju.
Ne sekvencira se, dakako, sam virus, nego njegov RNA. Konstantan napredak tehnologije učinio je da su uređaji koji provode ovako složene operacije ne veći od malo kvalitetnijeg laserskog printera. Unatoč tako naprednim strojevima, u Hrvatskoj je do sada sekvencirano tek šest genoma, i to na osobni zahtjev ljudi koji su bili voljni platiti 750 eura koliko to košta. Nevelik iznos ako se zna da je tek do prije nekoliko godina tako nešto stajalo i desetak tisuća eura. – Možemo pročitati sve ono što je poznato o pojedinom genu pa tako i nepravilnosti, možemo vam reći za koje ste bolesti predisponirani. Da je više novca, mogli bismo tako nešto napraviti i na puno širem nivou, dobiti jasnu sliku o stanju nacije – kaže nam dr. Vugrek. Na instrumentima koje posjeduje Laboratorij za naprednu genomiku već dulji niz godina provode se različite genomske analize, od istraživanja genetike raka do nasljednih bolesti, gdje se stečeno iskustvo u ovom slučaju implementira za razvoj platforme za analizu SARS-CoV-2. Važno je napomenuti da je pritom potpuno razvijen vlastiti protokol te se ne ovisi o vrlo skupim komercijalnim kitovima. Ovo iskustvo na SARS-CoV-2 može se dalje primijeniti za razvoj platformi za analize drugih virusa, npr. virusa gripe,virusa Zapadnog Nila (WNV) i drugih koji se također sustavno prate širom svijeta, no nažalost ne prate se i u Hrvatskoj. Prirodan je izazov bio sekvencirati genom virusa koji je zamrznuo svijet. U ovu temu uključili smo, uz dr. Vugreka, još dvojicu znanstvenika koja su vodila ovaj projekt, tu su i dr. Jurak te dr. Rukavina, koji je i dekan Medicinskog fakulteta u Rijeci. Što je najvažnije što smo doznali sekvenciranjem SARS-CoV-2.
Znanstvenici su se koristili tehnikom koja se naziva „sekvenciranje DNA nove generacije“ ili masivno paralelno sekvenciranje. Zapravo je riječ o vrlo sofisticiranoj metodi koji zahtijeva specifičnu opremu (u našem slučaju Illumina MiniSeq) i visokospecijalizirane stručnjake. Glavna karakteristika ove tehnologije je da omogućava istodobnu, ali iznimno osjetljivu analizu velikog broja uzoraka te se generira enormno velika količina podataka koju je moguće analizirati samo uz pomoć bioinformatičkih alata. – Na sreću, u našim laboratorijima rade iznimno talentirani mladi stručnjaci poput Filipa Rokića i Lovre Trgovec-Greifa s Instituta “Ruđer Bošković” te Andreje Zubković i Marine Matešić Pribanić sa Sveučilišta u Rijeci, koji s lakoćom rješavaju i najzahtjevnije zadatke – govore naši sugovornici. – Važno je naglasiti da je prvobitni virus koji je izoliran krajem 2019. u Kini i proširio se cijelim svijetom stigao do Hrvatske već znatno promijenjen, odnosno mutiran. Virus SARS-CoV-2, odnosno uzročnik bolesti COVID-19, mutira relativno brzo (iako manje od npr. virusa gripe) te je moguće uočiti male razlike u vrlo kratkom razdoblju. Na primjer, virus kojim je neka osoba zaražena neće nužno biti identičan virusima koje će prenijeti na novozaražene. Dakle, čitanje virusnog genoma (cjelokupnog nasljednog materijala sačinjenog od slova ACT/UG), a samim time i njegovih mutacija, omogućuje nam tehnika koja se naziva sekvenciranje – objašnjava nam dr. Vugrek.
Predispozicije za bolesti
Za ilustraciju, dodaje dr. Jurak, poznavanje čovjekova genoma, odnosno gena može nam otkriti predispoziciju za neku bolest, i dovoljna je samo jedna mala promjena jednog slova genskog zapisa (npr. A u G) da se razvije bolest. – Slično je i kod virusa, mutacije mogu dovesti do niza promjena u biologiji samog virusa. Mutacijama virus može postati virulentniji (agresivniji) ili manje agresivan, može se prilagoditi domaćinu, izbjeći imunološki odgovor ili osjetljivost na lijekove. Mutacije su također razlog prelaska koronavirusa sa životinje na čovjeka. Osim toga, analizom dinamike promjena napravljena je mapa širenja virusa širom svijeta (što vrlo zorno prikazuje web-stranice nextstrain.org) i jednako tako možemo analizirati širenje virusa unutar Hrvatske. Posebno nas zanima dinamika širenja virusa nakon uspostave mjera ograničenog kretanja i socijalne udaljenosti te kakav su mjere efektpolučile – kaže dr. Jurak. Prirodno je pitati može li se sada prepoznati odakle je novi koronavirus stigao u Hrvatsku, koliko sojeva ima, jesu li neki od njih opasni. Odgovor je dvoznačan, odnosno, za sekvencirane viruse jest, no za cjelovitu sliku trebalo bi sekvencirati viruse prikupljene sa svih 2000 zaraženih u Hrvatskoj.
– Zastupljenost sojeva i njihovo podrijetlo moguće je odrediti molekularnom epidemiološkom tipizacijom metodama sekvenciranja genoma. Treba istaknuti kako je do danas samo u RH bilo više od 2000 inficiranih osoba, tako da je za odgovor na pitanje zastupljenosti i podrijetla sojeva potrebno organizirati „banku“ sojeva koja treba prikupljati izolirane virusne nukleinske kiseline koji se potom trebaju analizirati. Nakon toga trebaju se provesti postupci sekvenciranja (određivanja sljedova) nukleotida, iza čega slijedi bioinformatička analiza sljedova radi određivanja srodnosti. Svi dobiveni podaci tada se trebaju usporediti s podacima koji su dostupni u međunarodnim bazama podataka kako bi na temelju vremenskih i geografskih podataka dobili mogućnost određivanja podrijetla sojeva koji su prisutni u Hrvatskoj – objašnjava nam prof. Rukavina, nastavljajući kako je na pitanja o sojevima i njihovoj opasnosti u ovom trenutku nemoguće odgovoriti. – Za definiranje broja prisutnihsojeva, a posebno njihove virulencije, potrebno je prikupiti i analizirati velik broj uzoraka uz prikupljanje i analizu epidemioloških i kliničkih podataka koji su vezani uz svaki pojedinačni slučaj infekcije. Takve studije zahtijevaju izniman vremenski angažman, a uz to su potrebni i znatni materijalni i financijski resursi. Međutim, treba naglasiti da su slična istraživanja i u svijetu novijeg datuma. Naime, prvi slučajevi infekcije u Kini pojavili su se unazad svega nekoliko mjeseci, odnosno potkraj 2019. godine, a u RH je prvi slučaj zabilježen 25. veljače ove godine – kaže prof. Rukavina. Tako, moguće je odrediti odakle je došao 21 virus čiji je genom sekvenciran.
– Nakon što smo odredili genetski kod virusa, odnosno njih 21, jer za više nismo imali sredstava, možemo usporediti slijed svakog virusa međusobno i, naravno, sa svim postojećim genomima virusa u javnim bazama, kojih ima više od 12.000. Iako nismo imali prilike provesti detaljnu analizu, možemo sa sigurnošću zaključiti da je virus u Hrvatsku stigao u nekoliko navrata i da je najsličniji virusima sa sjevera Italije i Austrije, što ne iznenađuje. Međutim, uočili smo i postojanje virusa koji nisu došli tim putem, no za detaljnu analizu potrebno nam je još vremena. Virusi koji cirkuliraju u Hrvatskoj generalno odgovaraju šarenoj slicibrojnih sojeva kakva je zastupljena i širom Europe, za razliku od, primjerice, Australije ili Kine – opisuje dr. Vugrek. Iako bi to bio veliki zalogaj, sekvencirati genome virusa čiji bi se uzorci prikupili sa svih 2000 pozitivnih u Hrvatskoj ne bi bilo i nemoguće. – Naš je tim nedavno prijavio projekt Hrvatske zaklade za znanost s ciljem cjelokupne analize svih uzoraka virusa u Hrvatskoj, više od 2000 izolata virusa. Ovaj pristup predstavljao bi jedinstvenu analizu kojom bi se dali odgovori na brojna znanstvena pitanja uključujući navedene analize virulentnosti sojeva, dinamike mutacija, određivanje regija koje mutiraju više, adaptacije virusa, njegova širenja i sl. Želja nam je krenuti sa sustavnim traženjem faktora koji određene ljude predisponiraju za težak oblik bolesti.
Trenutačno je u fazi evaluacije projekt koji pokušava dati odgovore na pitanja faktora podložnosti za razvoj težih oblika COVID-19, proračun projekta iz domene nepovratnih sredstava je 12,4 milijuna kuna. Nadamo se pozitivnom ishodu evaluacije naših prijedloga. Međutim, važno je napomenuti da je za uspješan projekt nužna suradnja bazičnih znanstvenika različitih struka (molekularna biologija, virologija, epidemiologija) i kliničara te se nadamo da će naša grupa rasti i da ćemo uspostaviti suradnju s drugim centrima. Osim toga, valja također naglasiti da su naš rad snažno podržale matične institucije Sveučilište u Rijeci i Institut “Ruđer Bošković” te se nadam da ćemo uskoro osigurati i financije za daljnja istraživanja – kaže dr. Jurak.
Odgovora na pitanje o opasnosti pojedinog soja, dakle, u ovom trenutku nema, ali zna se kako se do njega može doći. – COVID-19 zbunjuje liječnike i znanstvenike širinom kliničkih manifestacija u naizgled istoj populaciji. Nedvojbeno je da starost i kronična stanja i oboljenja predstavljaju glavni rizik za razvoj teške bolesti. Međutim, isto je tako uočeno da mlađi, prethodno potpuno zdravi ljudi mogu teško oboljeti. S duge strane, prepoznat je veći brojosoba zaraženih SARS-CoV-2 koji, u najgorem slučaju, razviju blage simptome prehlade ili su sasvim bez simptoma (asimptomatični). Iako postoje brojne mogućnosti za odgovor na ovu zagonetku (npr. specifičnosti pojedinca, način infekcije i dr.), moguće je da odgovor leži u različitim mutacijama virusa, a na što će nam odgovor dati analiza genoma virusa. Trenutačno postoje tri glavna tipa virusa (klade), S, G, i V. Naziv je vezan za uočene promjene u virusu. Naši HR virusi pripadaju većinom u S kladu. Trenutačno vidimo u svijetu vise od deset kladi, odnosno podtipova virusa. Pretpostavljam da će se cjepiva razvijati za glavne klade virusa, to možete usporediti s cjepivom za gripu. Naime, ovisno o sezoni, cjepivo je prilagođeno za određene podtipove koji će se neke godine pojaviti – objašnjava dr. Jurak.
Virus nije iz laboratorija
Osim cjelovitog sekvenciranja genoma SARS-CoV-2 u Hrvatskoj, koje još mogućnosti pruža sekvenciranje 21 virusa? – Pandemija COVID-19 globalni je problem i globalno se pokušava pronaći rješenje, a mi doprinosimo u skladu s našim mogućnostima. Trenutačno u svijetu postoji više od 12.000 sekvenciranih genoma, a naših nekoliko predstavlja mali, ali važan doprinos. Smatramo da je od nacionalnog interesa sudjelovati u svjetskim naporima vezanim za COVID-19 ako za to postoje uvjeti, a dokazano postoje. Naš protokol naše je intelektualno vlasništvo i nadamo se da će ga brojni laboratoriji koristiti u svojem radu. Iz naše perspektive, mi smo otvoreni za sve vrste suradnje, posebice pružanja usluge sekvenciranja i razvoj testova za druge tipova virusa, pružali smo takvu uslugu 2019. godine, na tematici identifikacije rijetkih varijanti HIV-a, što je objavljeno u vrlo kvalitetnom međunarodnom časopisu Scientific Reports. Trenutačno pregovaramo o pristupanju većim konzorcijima kako bismo zajedničkim snagama dali odgovor na neka važna pitanja. Možemo ponuditi naš protokol, koji je naše intelektualno vlasništvo. To znači da nismo kupili određene gotove kemikalije koje su se pojavile tijekom ožujka, koje proizvode velike biotehnološke kompanije, nego smo ih sami dizajnirali, što nas je činilo neovisnima, dakle izbjegli smo uvoz komercijalnih i skupih kemikalija. Vlastiti je protokol bio glavni izazov jer nismo to mogli testirati, moralo je raditi iz prve – kažu naši sugovornici. I za kraj (naši sugovornici nisu prvi kojima smo postavili ovo pitanje) kako je nastao taj koronavirus?
– Iako se tehnikama molekularne biologije i manipulacijama nasljednog materijala mogu generirati virusi u laboratorijima, vrlo je nevjerojatno da se to zbilo u slučaju SARS-CoV-2. Kao prvo, u šišmišima i ljuskavcima pronađeni su virusi vrlo visoke sličnosti s uzročnikom COVID-19. A kao drugo, za postizanje visoke specifičnosti i posebnosti vezanja za svoj receptor ACE2 bila je potrebna prirodna selekcija virusa u domaćinu – zaključuju.
